实操指南｜Tomocube HT-X1 完整 Demo 实验：肺上皮细胞 3D 胶原基质无标记成像全流程

Tomocube 光学成像 2026-07-28

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做 3D 细胞微环境、肿瘤微环境、纤维化机制研究的老师常会踩坑：荧光标记干扰细胞原生行为、SHG 无法同步观测细胞形态、样本前处理繁琐还容易成像失真。 今天给大家一套可复刻的标准化 Demo 实验全流程，以人肺腺癌 A549 上皮细胞包埋 I 型胶原为样本，从试剂配制、样本前处理、上机成像到数据定量完整拆解，全程无外源标记，搭配 Tomocube HT-X1 plus全息断层成像，看完即可直接落地开展预实验。

一、实验整体概述

1. 实验目的

1. 标准化肺上皮细胞 3D 胶原基质样本前处理方案，适配 HT 低光毒长时延时成像；
2. 无标记同步获取细胞三维形态 + 胶原纤维网络全套三维 RI 断层数据；
3. 依托设备配套专属 TomoAnalysis 分析软件，一键完成胶原、细胞双维度定量，精准量化细胞牵拉引发的纤维排布、局部干质量差异；
4. 同步实现静态单帧成像、60min 长时动态时序两套数据采集方案。

2. 实验样本与设备

• 细胞：人肺腺癌上皮 A549 细胞（肺纤维化、肺部肿瘤侵袭经典体外模型）
• 基质：0.8mg/mL I 型鼠尾胶原
• 成像主机：Tomocube HT-X1 plus全息断层成像系统
• 专属定量分析软件：TomoAnalysis（HT-X1 plus原厂配套专业分析软件，设备标配，无需第三方插件）
• 配套耗材：共聚焦通用玻璃底成像皿
• 活细胞配套：37℃/5% CO₂恒温恒湿成像培养仓

3. 核心优势（对比传统成像样本处理）

✅ 全程无荧光染料 / 抗体，不干扰胶原聚合、细胞原生行为

✅ 低相干 LED 光源，光毒性极低，支持 2–26h 不间断延时拍摄

✅ 分析软件原厂配套：采集数据一键导入 TomoAnalysis，无需格式转换、第三方工具中转

✅ 前处理参数标准化，不同批次样本成像、定量重复性稳定

二、实验试剂与耗材清单

核心试剂

1. 4mg/mL 鼠尾 I 型胶原原液
2. 10× 无菌 PBS、0.1M NaOH 中和液
3. DMEM 完全培养基（10% FBS+1% 双抗）
4. 0.25% 胰酶 - EDTA 细胞消化液
5. 无菌 1×DPBS 清洗液

专用耗材

1. 共聚焦通用玻璃底成像皿
2. 预冷 1.5mL 离心管、低温低吸附移液枪头
3. 细胞计数板、无菌滤膜
4. 冰盒（胶原全程低温，提前抑制自发凝固）

配套仪器

HT-X1 plus全息断层成像系统、超净工作台、37℃细胞培养箱、低温离心机

三、分阶段样本前处理完整实操流程

阶段 1：A549 肺上皮细胞悬液制备（提前 24h 细胞扩增）

1. 细胞单层长至 70% 汇合度，弃去旧培养基，1×DPBS 清洗细胞 2 次；
2. 加入 0.25% 胰酶，37℃孵育 3min，轻拍培养皿使细胞完全脱落；
3. 加入等量完全培养基终止消化，1200rpm 离心 4min 收集细胞沉淀；
4. 弃上清，预冷无血清 DMEM 重悬沉淀，细胞计数，调整终浓度至8×10⁴ cells/60μL；
5. 细胞悬液全程置于冰盒避光备用，防止室温提前贴壁聚集。

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操作关键点：细胞浓度不宜过高，密度过大易发生细胞堆叠，后期 TomoAnalysis 难以完成单细胞精准分割。

阶段 2：0.8mg/mL 细胞复合胶原凝胶配制（冰上全程 10min 完成）

单皿总体系 60μL，添加顺序不可颠倒，顺序错误会直接导致胶原无法成型

1. 预冷 1.5mL 离心管，依次添加： ① 12μL 10× 无菌 PBS ② 逐滴加入 0.1M NaOH，调节混合液 pH 至 7.2–7.4（溶液呈淡粉色） ③ 48μL 4mg/mL I 型胶原原液
2. 轻柔颠倒离心管吹打混匀 100 次，严禁涡旋震荡（避免大量气泡产生成像伪影）；
3. 等量细胞悬液与中和胶原体系低温轻柔混匀；
4. 快速吸取 60μL 混合液，均匀铺于 TomoDish 中央成像区域；
5. 超净台静置 3min 排尽微小气泡，移入 37℃培养箱聚合 1h。

阶段 3：成像前样本平衡处理（上机前 5min 操作）

1. 胶原完全聚合后，沿皿壁缓慢添加 200μL 预热 DMEM 完全培养基覆盖凝胶；
2. 37℃、5% CO₂培养箱平衡 30min，消除温差造成的介质 RI 背景噪声；
3. 轻柔更换一次新鲜培养基，清除凝胶表面漂浮死细胞、杂质；
4. 彻底擦干底部外壁水渍，避免光路反光降低成像信噪比。

四、HT-X1 plus上机成像完整 Demo 操作流程

1. 仪器预设置

1. 开机启动 HT-X1 主机、活细胞温控仓，打开上机控制软件TomoStudio X，整机预热 30min 至 37℃、5% CO₂稳定；
2. TomoStudio X 内新建专属实验项目，样本分类选择「细胞模型」；
3. 标准化 Demo 成像固定参数：

   • 照明光源：444nm 低相干 LED 结构光
   • Z 轴轴向扫描范围：0–30μm（根据细胞大小具体调节）
   • 单视野尺寸：308×308μm
   • 两套成像分组预设： ▶ 静态单组成像：单次完整三维 RI 体积扫描（采集耗时 5min） ▶ 60min 动态时序成像：每 5min 采集一组完整三维断层数据

2. 样本装载与自动校准

1. 将培养皿平稳放置载物台，锁死防漂移固定卡扣；
2. 预览扫描，挑选细胞分布均匀、无气泡、无杂质的标准视野；
3. 软件自动背景校准；
4. 全自动三维 RI 断层重建，原始数据本地自动存储，可直接一键导入 TomoAnalysis。

五、配套定量分析流程（原厂 TomoAnalysis 专业分析软件，全流程闭环）

TomoAnalysis 是 Tomocube 设备标配专用定量分析软件，专为全息断层 RI 数据优化，成像数据无缝导入，内置 AI 分割、RI - 干质量换算模块，全程无需外接第三方工具，一站式完成胶原网络、上皮细胞双维度定量分析：

1. 打开 TomoAnalysis，直接读取 TomoStudio X 输出的原始三维 RI 断层数据集，无需格式转换；
2. 内置行业标准 RI - 干质量换算公式（预设介质 RI、蛋白比折射率增量固定参数），逐像素积分自动计算单纤维关联干质量；

六、预期成像数据模版分享

1. 可视化图像产出

1. 把TomoAnalysis 输出的数据整理成 3D RI 深度伪彩渲染图：高亮区域为 A549 细胞，完整环绕连续胶原纤维网络；
2. Z 轴分层切片成像：z=0μm、z=4.8μm 分层视图，清晰区分细胞本体与周边重塑胶原；
3. 时序时间色编码投影：不同色彩标记 0–60min 纤维位移、弯曲变化区域；
4. TomoAnalysis 原生纤维分割彩图：不同色彩标记独立胶原纤维，直观区分细胞近端 / 远端纤维密度差异。

2. 定量数据（模版）

1. 空白胶原组平均纤维宽度：____ μm；细胞包埋组平均纤维宽度：____ μm
2. 细胞周边胶原单纤维干质量：____ pg；远端胶原单纤维干质量：____ pg
3. 60min 时序全域平均 Δn：基线____ → 峰值____，呈现稳步上升后趋于平台
4. 细胞周围胶原纤维取向各向异性系数：____，显著高于无细胞空白基质

七、Demo 实验标准实验结论（适配肺上皮 / 纤维化研究）

1. 前处理适配性结论本套方案，可稳定制备均质无气泡、结构完整的 3D 上皮细胞胶原样本，匹配 Tomocube 无标记成像体系，批次间成像、TomoAnalysis 定量重复性优异，彻底规避荧光标记、高能量激光对细胞微环境的干扰。
2. 软硬件一体化技术结论搭配原厂双软件体系（TomoStudio X 成像控制 + TomoAnalysis 专业定量），单次无标记无损测量即可同步捕获上皮细胞、胶原纤维两套三维 RI 信号；数据原生互通，无需第三方插件、文件转换即可完成从成像到定量全流程闭环。对比 SHG 仅能观测胶原、荧光成像需要外源标记的方案，本体系可同步实现细胞形态、胶原网络、蛋白干质量三重同步定量。
3. 生物学实验结论A549 肺上皮细胞包埋于 I 型胶原后，依靠细胞收缩力重塑周边基质：细胞近端胶原纤维宽度、局部干质量显著提升，纤维沿细胞边界定向排布；60min 长时延时成像搭配 TomoAnalysis 时序定量，可完整捕获早期上皮 - 基质重塑全过程，适用于肺纤维化、肺癌侵袭、上皮 - 基质互作预实验与药物筛选模型。
4. 方案延伸结论本套样本前处理、成像、TomoAnalysis 定量完整流程可直接迁移至 III 型胶原、原代肺上皮、气道类器官样本；仅需微调胶原终浓度、细胞铺板密度，依托原厂分析软件即可完成同类标准化定量，形成成熟纤维化研究 Demo 体系。

八、高频前处理 & 软件问题答疑

Q1 胶原凝胶出现大量气泡，成像布满黑色伪影怎么办？

A：全程禁止涡旋，移液吹打力度轻柔；铺胶后静置 3min 再入培养箱；枪头全部提前预冷，减少温差产生微小气泡。

Q2 延时成像过程中样本漂移、图像模糊？

A：使用共聚焦通用成像皿带固定卡扣载物台；培养基足量覆盖凝胶，防止蒸发收缩；温控仓提前 30min 平衡温度。

Q3 细胞在凝胶内形态皱缩、活性变差，无法长时间动态观测？

A：1. 胶原中和后温度过低，混合细胞前放置室温回温 1min；2. 培养基更换操作动作过猛，渗透压骤变损伤细胞；3. 成像仓氧气浓度适配肺部细胞模型，避免低氧应激。

文末福利

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